用于提高玉米秸秆挥发性脂肪酸产量的发酵方法与流程

1.本发明涉及青贮技术领域，具体为用于提高玉米秸秆挥发性脂肪酸产量的发酵方法。


背景技术：

2.玉米秸秆是最常见的农业副产品之一，玉米秸秆的合理利用将缓解生物燃料/牲畜生产中的能源危机或饲料短缺，从而减轻其处置带来的土地和空气污染风险；在实践中，由于延迟收获玉米秸秆木质纤维素含量和木质化程度较高，其利用效率普遍较低；因此，在加强厌氧发酵方面取得了一些技术进步，如选择常青品种和优化收获成熟期；在这些尝试中，由于产量和营养价值相对较高，直接去穗玉米显示出较高的厌氧发酵潜力，如何保存去穗玉米的潮湿残留物对于全年稳定供应是相关且重要的；
3.青贮是一种保存湿润材料的经济方法，在贮藏过程中，乳酸菌可以在厌氧条件下将水溶性碳水化合物(wsc)转化为乳酸和挥发性脂肪酸(vfa)等有机酸；青贮饲料也是厌氧发酵过程(水解、产酸、产乙酸和产甲烷)的有利步骤；氢气和甲烷是厌氧发酵的最终产物，而来自中间产酸阶段的乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸也具有很高的工业价值；同时，青贮中有机酸作为中间代谢产物，其产量的增加也会促进随后的沼气排放；
4.在现有技术中，通常使用布氏乳杆菌用于从乳酸的厌氧代谢中产生乙酸和丙酸等挥发性脂肪酸，然而乙酸主要在青贮后期(》45d)产生，这不利于去穗玉米立即厌氧发酵产沼气；而且同型发酵乳酸菌，如植物乳杆菌只产生乳酸，无法促进挥发性脂肪酸的产率。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供用于提高玉米秸秆挥发性脂肪酸产量的发酵方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于提高玉米秸秆挥发性脂肪酸产量的发酵方法，包括以下步骤：步骤一，原料获取；步骤二，原料预处理；步骤三，添加菌剂；步骤四，压实密封；步骤五，青贮发酵；步骤六，产品检测；
7.其中在上述步骤一中，收集新鲜玉米秸秆作为原料，清除泥土和其他杂物后备用；
8.其中在上述步骤二中，使用秸秆粉碎机将步骤一中所收获的新鲜玉米秸秆切碎，得到秸秆碎料；
9.其中在上述步骤三中，取类植物乳杆菌(lpp)在无菌水中稀释，制备出菌剂，按照5l菌剂/t的比例进行喷洒，将菌剂均匀喷洒到步骤二中制备的秸秆碎料上；
10.其中在上述步骤四中，将步骤三添加了菌剂的秸秆碎料逐层压实，填充到密闭容器中，盖上盖子后用封口膜进行密封保存；
11.其中在上述步骤五中，将步骤四中装有秸秆碎料的密闭容器放置在发酵室内进行青贮发酵，发酵时间为60天以上；
12.其中在上述步骤六中，发酵完成后对产品进行质量检测，检测合格后，密闭保存待
用。
13.优选的，所述步骤二中，秸秆碎料的长度为1-3cm。
14.优选的，所述步骤三中，秸秆碎料中含类植物乳杆菌(lpp)活菌数含量达到105cfu/g fm。
15.优选的，所述步骤四中，压实密度达到0.57-0.6kg/cm3。
16.优选的，所述步骤五中，发酵室的内部温度为20-30℃。
17.优选的，所述步骤六中，质量检测项目包括ph值、化学成分、微生物种群和细菌群落。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过在青贮原料中接种lpp，有效提高玉米秸秆在厌氧发酵过程中的挥发性脂肪酸的产率，从而限制酵母菌和其他不良微生物的生长繁殖，为后续去穗玉米甲烷发酵提供有利条件；同时接种lpp可以改变了青贮饲料的细菌群落组成，有利于青贮的安全保存。
附图说明
19.图1为本发明的方法流程图；
20.图2为发酵过程中样品ph值变化曲线图；
21.图3为发酵过程中样品乳酸含量变化曲线图；
22.图4为发酵过程中样品氨氮水平变化曲线图；
23.图5为发酵过程中样品乙酸含量变化曲线图；
24.图6为发酵过程中样品丙酸含量变化曲线图；
25.图7为发酵过程中样品丁酸含量变化曲线图；
26.图8为发酵过程中样品乳酸菌种群数量曲线图；
27.图9为发酵过程中样品酵母菌种群数量曲线图；
28.图10为发酵60天后的样品中优势菌属相对丰度条形图；
29.图11为发酵60天后的样品中优势菌种相对丰度条形图；
30.图12为不同处理中分析微生物的基因数量条形图；
31.图13为发酵60天后的样品中细菌群落结构pcoa图
32.图14为发酵60天后的样品中细菌群落功能预测条形图；
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.请参阅图1-14，表1-3，本发明提供的一种技术方案：
35.实施例：
36.用于提高玉米秸秆挥发性脂肪酸产量的发酵方法，包括以下步骤：步骤一，原料获取；步骤二，原料预处理；步骤三，添加菌剂；步骤四，压实密封；步骤五，青贮发酵；步骤六，产品检测；
37.其中在上述步骤一中，收集新鲜玉米秸秆作为原料，清除泥土和其他杂物后备用；
38.其中在上述步骤二中，使用秸秆粉碎机将步骤一中所收获的新鲜玉米秸秆切碎至1-3cm长度，得到秸秆碎料；
39.其中在上述步骤三中，取类植物乳杆菌(lpp)在无菌水中稀释，制备出菌剂，按照5l菌剂/t的比例进行喷洒，将菌剂均匀喷洒到步骤二中制备的秸秆碎料上，使秸秆碎料中含类植物乳杆菌(lpp)活菌数含量达到105cfu/g fm；
40.其中在上述步骤四中，将步骤三添加了菌剂的秸秆碎料逐层压实，填充到密闭容器中，密度达到0.57-0.6kg/cm3，盖上盖子后用封口膜进行密封保存；
41.其中在上述步骤五中，将步骤四中装有秸秆碎料的密闭容器放置在发酵室内，在20-30℃条件下进行青贮发酵，发酵时间为60天以上；
42.其中在上述步骤六中，发酵完成后对产品的ph值、化学成分、微生物种群和细菌群落进行检测，检测合格后，密闭保存待用。
43.对比例1：
44.具体操作方法与实施例相同，只将类植物乳杆菌(lpp)菌剂替换为等量的蒸馏水，作为control组。
45.对比例2：
46.具体操作方法与实施例相同，只将类植物乳杆菌(lpp)菌剂替换为等量的植物乳杆菌(lc)菌剂，作为lc组。
47.对比例3：
48.具体操作方法与实施例相同，只将类植物乳杆菌(lpp)菌剂替换为等量的副干酪乳杆菌(lp)菌剂，作为lp组。
49.分别在青贮3、7、15、30和60天的时候，对上述实施例和各对比例中的发酵物进行取样，共采集60个样品(4个处理方法
×
5个贮藏期
×
3个重复)，分析发酵物的发酵质量、化学成分、微生物种群和细菌群落组成，具体分析方法如下：
50.1)化学成分分析：
51.每个新鲜样品(20g)与180ml无菌水混合，在实验室榨汁机中均匀混合1min，然后用四层纱布过滤；滤液离心(4500
×
g，15min，4℃)；ph值由ph计测定；氨氮的测定采用broderick and kang(1980)的方法；使用高效液相色谱法分析乳酸、乙酸、丙酸和丁酸；
52.每个样品(约150g)经冷冻干燥等重以确定干物质(dm)含量，然后通过0.20mm筛粉进行化学成分分析；采用aoac(1990)法测定粗蛋白质(cp)；中性洗涤纤维(ndf)和酸性洗涤纤维(adf)均采用ankom2000纤维分析仪，采用van soest等人(1991)的方法进行测定；水溶性碳水化合物(wsc)是用mcdonald等人(1991)的方法测定的；
53.2)微生物种群分析：
54.每个样品上的微生物数量是用cai等人(1999)的方法测定的；采用串联稀释法制备青贮样品滤液；lab计数采用mrs琼脂(gcm188，陆桥科技有限公司，北京，中国)在37℃厌氧条件下(厌氧箱；teher硬厌氧箱，ax-1；弘泽有限公司，东京，日本)；酵母计数采用添加1.5mg/l四环素的麦芽提取物琼脂(cm173，陆桥科技有限公司，北京，中国)，28℃培养48h；
55.3)细菌群落分析：
56.用ctab法提取每个样本的总基因组dna；用无菌水将纯化后的dna稀释到1ng/ml；
使用特定的引物(27f和1514r)和条形码扩增了全长16s核糖体rna(rrna)基因(yan et al.，2019)；pcr反应采用fastpfu dna聚合酶(transgen biotech)进行；pcr产物按等密度比混合，用qiaquick@gel extraction kit(qiagen)纯化；根据制造商的建议，使用smrtbelltm template prep kit(pacbio)生成文库，然后在pacbio sequel平台上进行测序；原始序列由novogene bio technology co.，ltd.，beijing，china处理，用于标注silva数据库的ssurrna数据库中的分类信息；构建系统发育关系后，在magic平台上进行细菌群落的alpha多样性、pcoa图和功能预测；按照braun et al.(2011)的方法，使用定量pcr(qpcr)来估计细菌的16s rrna基因片段数；将总细菌16s rrna基因片段数(通过qpcr获得)与相对丰度(通过高通量测序获得)相乘，计算各细菌种的个体丰度；
57.4)数据分析：
58.采用sas程序9.1版(sas institute，cary，nc)对储存过程中化学成分、微生物种群和细菌群落指数的变化数据与duncan试验进行反复比较；只有概率水平为0.05时，才认为差异有统计学意义(p《0.05)；
59.5)结果分析：
60.与对照相比，接种lpp后乙酸含量提高了39.91％，丁酸含量降低了38％，残余粗蛋白质含量较高；此外，接种lpp降低了青贮发酵过程中细菌的alpha多样性指数，而布氏乳杆菌(l.buchneri)和希氏乳杆菌(l.hilgardii)在青贮发酵过程中占主导地位；特别是在青贮早期，接种lpp抑制了酵母的生长和丙酸的产生，但持续刺激厌氧发酵，使氨氮水平与lp相当；上述结果表明，青贮时接种lpp有利于产生中间代谢物(乙酸和丙酸)，为后续去穗玉米甲烷发酵提供条件。
[0061][0062]
表1去穗玉米发酵前的化学成分和微生物组成数据表
[0063][0064]
表2发酵60天后去穗玉米的化学成分表
[0065][0066]
表3去穗玉米发酵60天后的细菌菌落数据表
[0067]
基于上述，本发明的优点在于，通过在青贮原料中接种lpp，有利于乳酸向丙酸的转化，有利于产生中间代谢物(乙酸和丙酸)，从而限制梭状芽胞杆菌发酵，抑制酵母菌和其他不良微生物的生长繁殖，为后续去穗玉米甲烷发酵提供条件；同时接种lpp可以改变了青贮饲料的细菌群落组成，在青贮末期提供酸性环境加速了氮相关循环的消失，有利于青贮的安全保存。
[0068]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。